聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应研究

刘加强^{1, 3},蒋圆圆^2*,杨杨阳¹,程海²,徐蕾²,刘强¹,陈天池¹

(1.徐州工程学院环境工程学院,江苏 徐州 221111；2.江苏省徐州环境监测中心,江苏 徐州221000,

3.中国矿业大学环境与测绘学院,江苏 徐州 221116）

摘  要：传统塑料在环境中持久存在,严重威胁水生态安全和人体健康,对其毒性效应进行评估受到全球广泛关注.作为传统塑料的替代品,生物可降解塑料的应用越来越多,然而其对水生生物的生态风险在很大程度上未知.为了进一步揭示生物可降解微塑料对水生生物的影响,以大型溞为模式生物,研究了聚乳酸（PLA）对其急慢性毒性效应.结果表明,PLA对大型溞的半数效应浓度（48h-EC₅₀）为59.43 mg/L,95%置信区间为53.55-65.97mg/L.经紫外照射处理的PLA毒性降低.PLA对大型溞游泳活力和摄食行为有浓度依赖性的抑制作用.与对照组相比,100mg/L的PLA显著抑制了大型溞的心率和胸肢活动率,最大抑制率分别为31.4%和17.7%.21d长期暴露,10mg/L和40mg/L的PLA均一定程度上抑制了大型溞的生殖及内禀增长率（r_m）,但其影响并不显著.40mg/L的PLA显著降低了大型溞的存活率,存活率仅为20%.PLA的暴露显著诱导了超氧化歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的活性,表明大型溞受到氧化胁迫并引起脂质过氧化损伤.PLA在浓度40mg/L时显著抑制了乙酰胆碱酯酶的活性,从而引起大型溞神经毒性和运动失调.该结果对于综合评判及预测生物可降解微塑料的生态风险具有重要理论意义和实际价值.

关键词：微塑料；聚乳酸；大型溞；毒性效应

微塑料（MPs）在自然环境中普遍存在,由于其粒径小、难降解,在环境可中存在数百至数千年,严重威胁水生态安全和人体健康,成为全球共同面对的一个新的问题和挑战.野外调研和室内实验研究表明,水环境中的MPs能被水生生物摄入^{[1, 2]}.摄入的微塑料会随着食物链传递,而对不同营养级生物健康产生危害^{[3, 4]}.主要表现在生长抑制、组织损伤、氧化应激、生殖毒性、神经毒性和代谢紊乱等多种毒性效应.

传统塑料（如聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）、聚氯乙烯（PVC）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等）是稳定的高分子聚合物,环境中难以降解.为了应对传统塑料对环境日益严重的污染,生物可降解塑料（如聚乳酸（PLA）、聚羟基丁酸脂（PHA）和聚丁二酸丁二酯（PBS）等）应运而生,成为了传统石油基塑料的替代品.生物可降解塑料进入环境后短期内会产生大量微塑料,从而对水生态系统产生影响.有研究发现,PLA较PET更容易被斑马鱼摄入,摄入的PLA会对斑马鱼造成肠道损伤,并引起肠道菌群结构和功能的特异变化^[5].PVC和PLA都会对大型溞的生长、繁殖产生负面影响,PVC的影响主要归因于材料中的添加剂,而PLA的影响是由颗粒本身引起的^[6].与传统石油基MPs相比,生物基可降解MPs有着不同的结构和性质,同时其短期内能够产生显著的变化,与其他共存污染物的相互作用与传统塑料相比也不尽相同.在毒性效应方面,生物基MPs对水生生物的影响与石油基MPs相比也必然有着显著差异.生物基MPs可能与传统MPs一样有毒,然而目前生物基微塑料对水生生物的生态风险仍在很大程度上未知,有待进一步研究.

为了揭示生物基MPs暴露对水生生物的毒理学效应,本实验选取模式生物大型溞为受试生物,以使用最广泛的生物基塑料PLA为研究对象,通过急性和慢性毒性实验,探究PLA对大型溞生长发育,生殖,游泳和摄食等生态行为学指标的影响,分析大型溞抗氧化系统和神经系统酶活性的变化以及脂质代谢系统的影响,以期为PLA污染的风险预测和合理防控提供参考.

1  材料与方法

1.1  实验材料和试剂

大型溞购自中国科学院水生生物研究所,其培养条件为温度20±1ºC,光暗比16h:8h,光照强度为1200lx.采用农夫山泉天然矿物质水作为培养液,每周更换2次,以小球藻为食物,每天一次,喂食密度为10⁵ cells/mL.350目的聚乳酸（P LA）购自中国淘宝.总蛋白（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC）活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所.

1.2  急性毒性实验

参照OECD202标准方法进行急性毒性暴露试验^[7].在预实验的基础上设置6个暴露组（PLA浓度分别为10、20、40、80、100、200mg/L）和1个空白对照组（不添加PLA）,每个处理组3个平行.为确保PLA能够均匀分散,暴露组实验前需连续搅拌2h.为揭示紫外老化作用对PLA毒性的影响,相同设置条件下,暴露组实验前需经紫外灯（UVA-340,40W）照射处理24h（UV-PLA）.在实验中,往100 mL烧杯中加入 50 mL培养液,随机加入10只溞龄在6-24 h的健康幼溞,期间不投喂、不更换培养液.暴露24h、48h后分别记录每个烧杯中幼溞的抑制率.

1.3 游泳活力测定

48h暴露结束后,取大型溞活体置于6孔培养皿中,每孔1只,逐个进行追踪.每孔中暴露溶液 1.5 cm高,以保证生物只发生二维平面的位移.适应 5 min后,使用数码相机以每秒30帧的速度记录下每只大型溞的运动轨迹,持续1min.然后使用图像处理软件Tracker^®5.1.5对视频进行分析.设置比例尺和坐标原点后,逐帧对大型溞的坐标进行捕捉,绘制出大型溞的运动轨迹,并逐帧计算其平均速度v和加速度a.每个处理组取10只大型溞,其均值为该处理组的最终结果.

1.4 摄食率的测定

   根据Zhu^[8]等人的方法进行摄食试验.48h暴露结束后,随机挑选20只大型溞转移到含有小球藻（初始密度约为1×10⁶ cells/mL）的暴露液中,黑暗条件下暴露5h.利用血球计数板计数的方法分别测定暴露前和暴露结束时小球藻密度,每个处理组重复3次.计算滤水滤（F）和摄食率（I）式中：C₀和C_t分别代表起始和终点小球藻的浓度（cell/mL）；t为暴露时间（h）；n为大型溞的个数；V为暴露液体积（mL）；C_t'为对照组终点小球藻浓度（cell/mL）；A为校正因子.

1.5 心跳速率和胸肢活动率测定

48h暴露结束后,用吸管将大型溞转移至载玻片上,滴入适量暴露溶液.将载玻片置于配备CCD摄像机的光学显微镜下观察,捕捉其心脏和胸支,生物适应1min后,对其心跳和胸肢活动进行60s的录像.然后使用计数器对录像结果进行大型溞跳动次数的计数, 每个视频计数3次.每个处理组取 5只大型溞,其均值作为该处理组的最终结果.

1.6慢性毒性实验

参考OECD211标准方法进行21d慢性毒性实验^[9],根据急性毒性实验结果中48h-EC₅₀值,慢性毒性实验设置了低、高两个暴露组（PLA浓度为10mg/L和40mg/L）以及空白对照组（不添加PLA）.试验在100mL烧杯中进行,每个烧杯放入1只健康幼溞（6～24 h）和50 mL培养液,每个处理组设置10个重复,用于生殖实验.另在盛有800 mL暴露溶液的1000 mL烧杯中随机挑选200只健康幼溞（6～24 h）,用于抗氧化损伤实验.在实验期间,每天投喂小球藻（密度为10⁵ cells/mL）,每两天更换一次培养液,并每天记录大型溞的存活数、产溞数,死亡数,挑出新生幼溞,直到21 d结束.实验结束后,统计首次产溞时间、首次产溞数、单雌产溞数和产胎数等数据,并计算内禀增长率r_m^[10].另外,21d暴露结束后,测定SOD、T-AOC、AChE和MDA等的活性,测试方法参考试剂盒中提供的进行.

1.7数据分析

采用SPSS 25.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey's多重比较检验.数据结果表示为平均值±标准差,P<0.05表示存在显著性差异.数据绘图采用GraphPad Prism 5和Origin 2018实现.

2 结果与讨论

2.1 聚乳酸（PLA）的特征

PLA的SEM图像如图1a和1b所示,整体大小不一、形状极不规则；表面粗糙呈鳞片状并伴有裂缝；经紫外线老化处理的PLA(UV-PLA)如图1c和1d所示,在形貌上并没有发现明显的变化.在PLA浓度为200mg/L时,其粒度分布如图2(a)所示,d(0.1),d(0.5)和d(0.9)分别为3.089,18.085和71.567um；对应的UV-PLA粒度分布如图2(b)所示,d(0.1),d(0.5)和d(0.9)分别为3.039,15.675和52.302um.粒径的减小说明紫外老化作用加速了PLA的降解.大型溞是滤食性生物,Kokalj等人^[11]的研究表明,大型溞能够摄食粒径范围0.7–70 um的微塑料.大型溞因误食微塑料,产生错误的饱腹感,影响其生长发育,从而减少生物多样性.

在2996、1757、1385和1088cm^-1处观察到PLA的典型红外吸收峰^[12],如图2所示.在2996cm^-1处的吸收峰代表甲基C-H的伸缩振动^[13],1757cm^-1处的吸收峰与酯基C=O的伸缩振动有关^[14],1385cm^-1附近的吸收峰是由甲基C-H的弯曲振动引起的^[14],在1088cm^-1处观察到非对称桥接C-O-C的伸缩振动^[15],表明分子中存在环状内酯结构^[16].此外,在1620cm^-1附近的吸收峰是由羰基C=O的伸缩振动引起的^[17],这可能是由于PLA中的添加剂引起的^[18].经紫外老化处理的PLA（UV-PLA）相应特征峰的强度明显降低,进一步证实聚乳酸发生了降解.

不同浓度PLA暴露溶液中TOC浓度及释放率如图4所示,从图4可见,总有机碳(TOC)浓度随着PLA暴露溶液的浓度增加而增加.由图4(a)所示,PLA浓度与TOC浓度之间存在显著线性正相关（p<0.05）,相关关系R²为0.998；Belehradek方程能够较好的描述PLA释放TOC的过程,相关系数R²为0.945；由图4(b)所示,对应浓度下UV-PLA溶液TOC浓度均高于PLA,相应增加了0.017~1.36倍.同样的,UV-PLA浓度与TOC浓度之间为显著线性正相关（p<0.05）,相关关系R²为0.993,TOC释放率用Belehradek方程拟合的相关系数R²为0.996.聚乳酸浸出释放的有机物质,可能影响到大型溞的毒性效应.

2.2  PLA暴露对大型溞活动抑制的影响

在暴露过程中,空白组大型溞未发现受到抑制的情况.PLA单独暴露对大型溞的活动抑制率如图5所示,结果表明,随着暴露时间的增加,大型溞的活动抑制率也随之增加.如图5（a）所示,PLA对大型溞的活性抑制率呈浓度依赖性增加,当浓度为200mg/L时,48h活动抑制率接近100%,表明高浓度PLA对水环境中大型溞的活动能力产生更不利影响.

根据剂量-效应关系方程^[19]：Y=Bottom+(Top- Bottom) /(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope)),基于GraphPad Prism 5.0对数据进行拟合,直接得到剂量-效应曲线和EC₅₀如图5（b）所示.暴露24h和48h,剂量-效应关系均成“S”型曲线.PLA对大型溞 24h和48h的 EC₅₀值分别为83.12和59.43 mg/L,95%的置信区间分别为70.43-98.09和53.55-65.97mg/L.Zimmermann^[6]等研究了不规则微塑料聚氯乙烯（PVC）,聚氨酯（PUR）,聚乳酸（PLA）和高岭土暴露对大型溞21d的慢性毒性影响,发现所有类型微塑料（＜59um）都降低了大型溞后代的繁殖数量